慢病毒使用操作手册

慢病毒使用操作手册

1. 慢病毒安全使用规范

1.1汉尹生物使用的是第三代慢病毒高效率包装系统，具有很高的安全性（将gag, pol和rev基因分到了不同质粒中；去掉了tat transact tivation基因）。

1.2 病毒操作时最好使用生物安全柜，如使用普通超净工作台操作病毒，一定要关闭风机。

1.3 病毒操作时必须穿实验服，带口罩和手套。

1.4操作病毒时必须特别小心，不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，立即用10%次氯酸钠溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液于10%次氯酸钠溶液内浸泡1h以上后弃去。

1.5用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。

1.6病毒操作完毕后，脱掉手套，用肥皂和水清洗双手。

1. 慢病毒的储存与稀释

2.1病毒的储存：客户在收到慢病毒液后，如果在很短的时间内就开展实验的话，可以将病毒置于4℃保存；如果长期保存可将病毒装入冻存管中置于-80℃冰箱（注意：病毒可以在-80℃保存6个月，如果超过6个月，建议使用前重新测滴度）。

2.2反复冻融对病毒的滴度是有影响的，每次冻融会使病毒的滴度降低10%左右，所以尽量避免反复冻融，建议分装成小体积的方便每次使用。

2.3病毒的稀释：客户如需稀释病毒，可以先将病毒冰浴融化，再用目的细胞或PBS或无血清培养基稀释混匀后4℃保存，为保证病毒滴度，建议在3天内使用完毕。

1. 慢病毒体外感染实验

3.1感染和分析

瞬时表达：慢病毒感染细胞后，至少要培养24~48小时才能检测目的基因的表达。原因是慢病毒载体的基因组是RNA，需要反转录为DNA，并插入细胞染色体后才能表达。

1. 感染细胞最佳MOI的测定

MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti-eGFP）。

1. 感染方法

1. 按实验需要将细胞铺板（比如24孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃培养过夜。

2. 感染前，从-80℃冰箱取出后在冰浴融化病毒，用新鲜完全培养基稀释成所需浓度。注意：轻轻混匀，不要使用振荡器。

3. 吸去细胞原有培养基，将按照MOI稀释好的病毒液加入细胞中。

4. 加入Polybrene（对于293细胞，终浓度6μg/ml），轻轻摇匀。37℃培养过夜。注：慢病毒对目的细胞感染效率较低时，可以通过提高MOI值来提高感染效率，但是当MOI高于20时，我们建议客户添加Polybrene（终浓度2~12μg/ml，浓度因不同的细胞而异，具体的请参考相关文献）来提高病毒的感染效率。如果感染目的细胞是Jurkat，kasumi，NB4，H929，GBC-SD，MCF-7等，建议不要添加Polybrene；大部分原代细胞感染也不需要添加Polybrene，以上仅供参考，具体详见附录。

5. 感染24小时后，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基。

6. 继续培养48~72小时后，根据需要收集细胞检测目的蛋白的表达。